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一、 實驗原理

聚合酶鏈式反應 ( PCR) 可對特定核苷酸片斷進行指數(shù)級的擴增。在擴增反應結束之后，我們可以通過凝膠電泳的方法對擴增產物進行定性的分析，也可以通過放射性核素摻入標記后的光密度掃描來進行定量的分析。無論定性還是定量分析，分析的都是 PCR 終產物。但是在許多情況下，我們所感興趣的是未經 PCR 信號放大之前的起始模板量。例如我們想知道某一轉基因動植物轉基因的拷貝數(shù)或者某一特定基因在特定組織中的表達量。在這種需求下熒光定量 PCR 技術應運而生。所謂的實時熒光定量 PCR 就是通過對 PCR 擴增反應中每一個循環(huán)產物熒光信號的實時檢測從而實現(xiàn)對起始模板定量及定性的分析。在實時熒光定量 PCR 反應中，引入了一種熒光化學物質，隨著 PCR 反應的進行， PCR 反應產物不斷累計，熒光信號強度也等比例增加。每經過一個循環(huán)，收集一個熒光強度信號，這樣我們就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產物量的變化，從而得到一條熒光擴增曲線圖  。

 

一般而言，熒光擴增曲線擴增曲線可以分成三個階段：熒光背景信號階段 , 熒光信號指數(shù)擴增階段和平臺期。在熒光背景信號階段，擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，我們無法判斷產物量的變化。而在平臺期，擴增產物已不再呈指數(shù)級的增加。 PCR 的終產物量與起始模板量之間沒有線性關系，所以根據最終的 PCR 產物量不能計算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號指數(shù)擴增階段， PCR 產物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關系，我們可以選擇在這個階段進行定量分析。為了定量和比較的方便，在實時熒光定量 PCR 技術中引入了兩個非常重要的概念：熒光閾值和 CT 值。熒光閾值是在熒光擴增曲線上人為設定的一個值，它可以設定在熒光信號指數(shù)擴增階段任意位置上，但一般我們將熒光域值的缺省設置是 3-15 個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的 10 倍。每個反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環(huán)數(shù)被稱為 CT 值（ threshold value ）。

 

CT 值與起始模板的關系研究表明，每個模板的 CT 值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關系，起始拷貝數(shù)越多， CT 值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標代表 Ct 值（如圖 3 所示）。因此，只要獲得未知樣品的 Ct 值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。

熒光探針和熒光染料

實時熒光定量 PCR 的化學原理包括探針類和非探針類兩種，探針類是利用與靶序列特異雜交的探針來指示擴增產物的增加，非探針類則是利用熒光染料或者特殊設計的引物來指示擴增的增加。前者由于增加了探針的識別步驟，特異性更高，但后者則簡便易行。

1．SYBR Green I

SYBR Green I 是一種結合于小溝中的雙鏈 DNA 結合染料。與雙鏈 DNA 結合后，其熒光大大增強。這一性質使其用于擴增產物的檢測非常理想。 SYBR Green I 的最大吸收波長約為 497nm ，發(fā)射波長最大約為 520nm 。在 PCR 反應體系中，加入過量 SYBR 熒光染料， SYBR 熒光染料特異性地摻入 DNA 雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的 SYBR 染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與 PCR 產物的增加完全同步。

優(yōu)勢：SYBR Green I 在核酸的實時檢測方面有很多優(yōu)點，由于它與所有的雙鏈 DNA 相結合，不必因為模板不同而特別定制，因此設計的程序通用性好，且價格相對較低。利用熒光染料可以指示雙鏈 DNA 熔點的性質，通過熔點曲線分析可以識別擴增產物和引物二聚體，因而可以、區(qū)分非特異擴增，進一步地還可以實現(xiàn)單色多重測定。此外，由于一個 PCR 產物可以與多分子的染料結合，因此 SYBR Green I 的靈敏度很高。但是，由于 SYBR Green I 與所有的雙鏈 DNA 相結合，因此由引物二聚體、單鏈二級結構以及錯誤的擴增產物引起的假陽性會影響定量的精確性。通過測量升高溫度后熒光的變化可以幫助降低非特異產物的影響。由解鏈曲線來分析產物的均一性有助于分析由 SYBR Green I 得到定量結果。

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2．分子信標（molecular beacon）

分子信標是一種在靶 DNA 不存在時形成莖環(huán)結構的雙標記寡核苷酸探針。在此發(fā)夾結構中，位于分子一端的熒光基團與分子另一端的淬滅基團緊緊靠近。在此結構中，熒光基團被激發(fā)后不是產生光子，而是將能量傳遞給淬滅劑，這一過程稱為熒光諧振能量傳遞（ FRET ）。由于 " 黑色 " 淬滅劑的存在，由熒光基團產生的能量以紅外而不是可見光形式釋放出來。如果第二個熒光基團是淬滅劑，其釋放能量的波長與熒光基團的性質有關。分子信標的莖環(huán)結構中，環(huán)一般為 15-30 個核苷酸長，并與目標序列互補；莖一般 5-7 個核苷酸長，并相互配對形成莖的結構。熒光基團連接在莖臂的一端，而淬滅劑則連接于另一端。分子信標必須非常仔細的設計，以致于在復性溫度下，模板不存在時形成莖環(huán)結構，模板存在時則與模板配對。與模板配對后，分子信標的構象改變使得熒光基團與淬滅劑分開。當熒光基團被激發(fā)時，它發(fā)出自身波長的光子。

3．TaqMan 探針

 

圖 6 Taqman 探針工作原理

TaqMan 探針是多人擁有的專利技術。 TaqMan 探針是一種寡核苷酸探針，它的熒光與目的序列的擴增相關。它設計為與目標序列上游引物和下游引物之間的序列配對。熒光基團連接在探針的 5’ 末端，而淬滅劑則在 3’ 末端。當完整的探針與目標序列配對時，熒光基團發(fā)射的熒光因與 3’ 端的淬滅劑接近而被淬滅。但在進行延伸反應時，聚合酶的 5’ 外切酶活性將探針進行酶切，使得熒光基團與淬滅劑分離。 TaqMan 探針適合于各種耐熱的聚合酶，如 DyNAzymeTM II DNA 聚合酶（ MJ Research 公司有售）。隨著擴增循環(huán)數(shù)的增加，釋放出來的熒光基團不斷積累。因此熒光強度與擴增產物的數(shù)量呈正比關系。

4. LUX Primers

 

圖 7 LUX 引物工作原理

LUX (light upon extention) 引物是利用熒光標記的引物實現(xiàn)定量的一項新技術。目標特異的引物對中的一個引物 3’ 端用熒光報告基團標記。在沒有單鏈模板的情況下，該引物自身配對，形成發(fā)夾結構，使熒光淬滅。在有目標片斷的時候，引物與模板配對，發(fā)夾結構打開，產生特異的熒光信號（如圖 7 ）。

與 Taqman 探針和分子信標相比， LUX 引物通過二級結構實現(xiàn)淬滅，不需要熒光淬滅基團，也不需要設計特異的探針序列。因為 LUX 引物是一個相對較新的技術，所以其應用還有待實踐的檢驗。

二、實時熒光定量 PCR技術的應用

實時熒光定量 PCR 技術是核酸定量技術的一次飛躍。運用該項技術，我們可以對 DNA 、 RNA 樣品進行定量和定性分析。定量分析包括絕對定量分析和相對定量分析。前者可以得到某個樣本中基因的拷貝數(shù)和濃度；后者可以對不同方式處理的兩個樣本中的基因表達水平進行比較。除此之外我們還可以對 PCR 產物或樣品進行定性分析：例如利用熔解曲線分析識別擴增產物和引物二聚體，以區(qū)分非特異擴增；利用特異性探針進行基因型分析及 SNP 檢測等。目前實時熒光 PCR 技術已經被廣泛應用于基礎科學研究、臨床診斷、疾病研究及藥物研發(fā)等領域。其中最主要的應用集中在以下幾個方面：

1. DNA 或 RNA 的絕對定量分析。包括病原微生物或病毒含量的檢測, 轉基因動植物轉基因拷貝數(shù)的檢測，RNAi 基因失活率的檢測等。

2. 基因表達差異分析。例如比較經過不同處理樣本之間特定基因的表達差異 ( 如藥物處理、物理處理、化學處理等 )，特定基因在不同時相的表達差異以及cDNA 芯片或差顯結果的確證

3. 基因分型。例如 SNP 檢測，甲基化檢測等。

隨著實時熒光定量 PCR 技術的推廣和普及，該技術必然會得到更廣泛的應用。

三、實驗方法

1 樣品RNA的抽提

在收集到生物材料之后，最好能即刻進行RNA制備工作。若需暫時儲存，則應以液氮將生物材料急速冷凍后，儲存于-80℃冷凍柜。在制備RNA時，將儲存于冷凍柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式破碎細胞，不可以先行解凍，以避免RNase的作用。

1. 提取組織RNA時，每50～100mg組織用1ml Trizol試劑對組織進行裂解；提取細胞RNA時，先離心沉淀細胞，每5-10 ╳106個細胞加1ml Trizol后，反復用槍吹打或劇烈振蕩以裂解細胞；貼壁細胞可直接棄培養(yǎng)基后加Trizol裂解。

2. 將上述組織或細胞的Trizol裂解液轉入EP管中,在室溫15~30C下放置5分鐘；

3. 在上述EP管中，按照每1ml TRIZOL加0.2ml氯仿的量加入氯仿，蓋上EP管蓋子，在手中用力震蕩15秒，在室溫下（15℃～30℃）放置2～3分鐘后，12000g（2℃～8℃）離心15分鐘；

4. 取上層水相置于新EP管中,按照每1ml TRIZOL加0.5ml的量加入異丙醇，在室溫下（15℃～30℃）放置10分鐘,12000g（2℃～8℃）離心10分鐘；

5. 棄上清，按照每1ml TRIZOL加1ml 75%乙醇進行洗滌，渦旋混合，7500g（2℃～8℃）離心5分鐘，棄上清；

6. 讓沉淀的RNA在室溫下自然干燥；（RNA沉淀在70%乙醇中可長期保存）。

7. 用Rnase-free water 溶解RNA沉淀。

2 RNA質量檢測

1）紫外吸收法測定

先用稀釋用的TE溶液將分光光度計調零。然后取少量RNA溶液用TE稀釋（1:100）后，讀取其在分光光度計260nm和280nm處的吸收值，測定RNA溶液濃度和純度。

① 濃度測定

A260下讀值為1表示40 μg RNA/ml。樣品RNA濃度(?g/ml)計算公式為：A260 ×稀釋倍數(shù)× 40 μg/ml。具體計算如下：

RNA溶于40 μl DEPC水中，取5ul，1:100稀釋至495μl的TE中，測得A260 = 0.21

RNA 濃度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840μg/ml 或 0.84 μg/μl

取5ul用來測量以后，剩余樣品RNA為35 μl，剩余RNA總量為：

35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg

②純度檢測

RNA溶液的A260/A280的比值即為RNA純度，比值范圍1.8到2.1。

3 瓊脂糖凝膠電泳測定

1. 用蒸餾水將制膠模具和梳子沖洗干凈，放在制膠平板上，封閉模具邊緣，架好梳子；

2. 根據欲分離DNA片段大小用凝膠緩沖液配制適宜濃度的瓊脂糖凝膠：準確稱量瓊脂糖干粉，加入到配膠用的三角燒瓶內，定量加入電泳緩沖液（一般20~30 ml）；

3. 放入到微波爐內加熱熔化。冷卻片刻，加入一滴熒光染料，輕輕旋轉以充分混勻凝膠溶液，倒入電泳槽中，待其凝固；

4. 室溫下30～45分鐘后，凝膠完全凝結，小心拔出梳子，將凝膠安放在電泳槽內；

5. 向電泳槽中倒入電泳緩沖液，其量以沒過膠面1mm為宜，如樣品孔內有氣泡，應設法除去；

6. 在DNA樣品中加入10×體積的載樣緩沖液（loading buffer），混勻后，用槍將樣品混合液緩慢加入被浸沒的凝膠加樣孔內；

7. 接通電源，紅色為正極，黑色為負極，切記DNA樣品由負極往正極泳動 (靠近加樣孔的一端為負)。一般60～100V電壓，電泳20～40min即可；

8. 根據指示劑泳動的位置，判斷是否終止電泳；

9. 電泳完畢，關上電源，在凝膠成像儀上觀察電泳帶及其位置，并與核酸分子量標準Marker比較被擴增產物的大小。

4 紫外透射光下觀察并拍照

28S和18S核糖體RNA的帶非常亮而濃（其大小決定于用于抽提RNA的物種類型），上面一條帶的密度大約是下面一條帶的2倍。還有可能觀察到一個更小稍微擴散的帶，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖體RNA）組成。在18S和28S核糖體帶之間可以看到一片彌散的EB染色物質，可能是由mRNA和其它異型RNA組成。RNA制備過程中如果出現(xiàn)DNA污染，將會在28S核糖體RNA帶的上面出現(xiàn)，即更高分子量的彌散遷移物質或者帶，RNA的降解表現(xiàn)為核糖體RNA帶的彌散。用數(shù)碼照相機拍下電泳結果。

5樣品cDNA合成

①反應體系

序號 反應物 劑量

1 逆轉錄buffer 2μl

2 上游引物 0.2μl

3 下游引物 0.2μl

4 dNTP 0.1μl

5 逆轉錄酶MMLV 0.5μl

6 DEPC水 5μl

7 RNA模版 2μl

8 總體積 10μl

輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。

②混合液在加入逆轉錄酶MMLV 之前先70℃干浴3分鐘，取出后立即冰水浴至管內外溫度一致，然后加逆轉錄酶0.5μl，37℃水浴60分鐘。

③取出后立即95℃干浴3分鐘，得到逆轉錄終溶液即為cDNA溶液，保存于-80℃待用。

6梯度稀釋的標準品及待測樣品的內參基因（β-actin）實時定量PCR

①β-actin陽性模板的標準梯度制備陽性模板的濃度為1011，反應前取3μl按10倍稀釋（加水27μl并充分混勻）為1010，依次稀釋至109、108、107、106、105、104，以備用。

②反應體系如下：

標準品反應體系

序號 反應物 劑量

1 SYBR Green 1 染料 10μl

2 陽性模板上游引物F 0.5μl

3 陽性模板下游引物R 0.5μl

4 dNTP 0.5μl

5 Taq酶 1μl

6 陽性模板DNA 5μl

7 ddH2O 32.5μl

8 總體積 50μl

輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。

管家基因反應體系：

序號 反應物 劑量

1 SYBR Green 1 染料 10μl

2 內參照上游引物F 0.5μl

3 內參照下游引物R 0.5μl

4 dNTP 0.5μl

5 Taq酶 1μl

6 待測樣品cDNA 5μl

7 ddH2O 32.5μl

8 總體積 50μl

輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。

③制備好的陽性標準品和檢測樣本同時上機，反應條件為：93℃ 2分鐘，然后93℃ 1分鐘，55℃ 2分鐘，共40個循環(huán)。（可以做預實驗，優(yōu)化實驗方案。）

7制備用于繪制梯度稀釋標準曲線的DNA模板

①針對每一需要測量的基因，選擇一確定表達該基因的cDNA模板進行PCR反應。

反應體系：

序號 反應物 劑量

1 10× PCR緩沖液 2.5 ul

2 MgCl2 溶液 1.5 ul

3 上游引物F 0.5 ul

4 下游引物R 0.5 ul

5 dNTP混合液 3 ul

6 Taq聚合酶 1 ul

7 cDNA 1 ul

8 加水至總體積為 25ul

輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。

35個PCR循環(huán)（94℃1分鐘；55℃1分鐘；72℃1分鐘）； 72?C延伸5分鐘。

②PCR產物與 DNA Ladder在2％瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，檢測PCR產物是否為單一特異性擴增條帶。

③將PCR產物進行10倍梯度稀釋: 將PCR產物進行10倍梯度稀釋: 設定PCR產物濃度為1×1010，依次稀釋至109、108、107、106、105、104幾個濃度梯度。

8待測樣品的待測基因實時定量PCR

①所有cDNA樣品分別配置實時定量 PCR反應體系。

體系配置如下：

序號 反應物 劑量

1 SYBR Green 1 染料 10 ul

2 上游引物 1ul

3 下游引物 1ul

4 dNTP 1ul

5 Taq聚合酶 2ul

6 待測樣品cDNA 5ul

7 ddH2O 30ul

8 總體積 50 ul

輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。

②將配制好的PCR反應溶液置于Realtime PCR儀上進行PCR擴增反應。反應條件為：93℃2分鐘預變性，然后按93℃ 1分鐘，55℃1分鐘，72℃1分鐘，共40做個循環(huán)，最后72℃7分鐘延伸。

9實時定量PCR使用引物列表

引物設計軟件：Primer Premier 5.0，并遵循以下原則：引物與模板的序列緊密互補；引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結構；引物不在模板的非目的位點引發(fā)DNA 聚合反應(即錯配)。

10電泳

各樣品的目的基因和管家基因分別進行Realtime PCR反應。PCR產物與 DNA Ladder在2％瓊脂糖凝膠電泳，GoldView染色，檢測PCR產物是否為單一特異性擴增條帶。